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【精选编译】氯代霉素介导的CAR T细胞靶向治疗GBM具有高效特异性

2020-06-05 王文佳 高谋

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目前仍缺乏对胶质母细胞瘤的有效治疗手段。

美国希望之城医学中心的Dongrui Wang等设计一种基于CLTX的CAR,并评估CLTX-CAR T细胞治疗GBM的疗效,结果发表于2020年3月的《Science Translational Medicine》在线。


——摘自文章章节


【Ref: Wang D, et al. Sci Transl Med. 2020 Mar 4;12(533):eaaw2672. doi: 10.1126/scitranslmed.aaw2672.】


研究背景



目前仍缺乏对胶质母细胞瘤(GBM)的有效治疗手段。近年来,通过基因工程技术改造获得的表达嵌合抗原受体(CAR)T细胞有望成为治疗GBM的新手段。研究发现,从蝎子毒液中提取的氯代霉素(CLTX)可特异性结合GBM细胞。美国希望之城(City of Hope)医学中心的Dongrui Wang等设计一种基于CLTX的CAR,并评估CLTX-CAR T细胞治疗GBM的疗效,结果发表于2020年3月的《Science Translational Medicine》在线。

研究结果



作者的主要研究结果如下:


1.CLTX与GBM细胞结合性强:CLTX可与绝大多数GBM患者的病理标本内80%以上的肿瘤细胞结合。而且,CLTX与GBM细胞结合不受IL13Ra2、HER2和EGFR表达水平的影响。CLTX与GBM原代细胞系PBT-TS的结合率超过70%。CLTX结合肿瘤细胞的能力比IL13Ra2和EGFR更强。


GBM存在高度异质性,其中胶质瘤干细胞(GSC)具有自我更新和形成肿瘤的潜能,是CAR T细胞疗法的靶点。研究发现CLTX可与GSC和非GSC结合;CLTX结合CD44+或CD133+ GSC的比例高于分化的CD44-或CD133-肿瘤细胞。随着体外培养细胞分化,GSC标记物CD133表达水平逐渐降低,但与GBM细胞相结合的CLTX并未减少表明CLTX与GBM细胞结合性强,有望应用于CAR T细胞疗法中。


2.CLTX-CAR T细胞构建思路及体外抗GBM细胞的能力测试:研究采用含IgG4Fc(EQ)间隔序列和CD28共刺激结构域的CLTX构建CLTX-CAR。通过GBM原代细胞系PBT-TS评估CLTX-CAR T细胞的细胞毒性。在2小时内,CLTX-CAR T细胞与PBT-TS形成免疫突触结构。与GBM细胞共培养,CLTX-CAR T细胞明显激活,CD69和4-1BB(CD137)增加,并有脱颗粒(细胞表面CD107a)。共培养48小时,CLTX-CAR T细胞杀伤GBM细胞的效靶比(E:T)为1:4。此外,相比IL13Ra2-CAR T细胞对低表达IL13Ra2的PBT-TS无效,CLTX-CAR T细胞可识别并攻击所有类型的PBT-TS。由此可见,CLTX-CAR T细胞可识别并攻击GBM细胞,并且其细胞毒性与CLTX广泛结合GBM细胞的潜能相一致。


研究进一步比较多个间隔序列和共刺激结构域,结果发现CLTX中的EQ间隔序列和CD28共刺激结构域与其靶向杀伤GBM细胞关系密切。此外,相比CD8h间隔序列,含EQ间隔序列的CLTX-CAR T细胞表现出更持久的抗肿瘤活性。


3.CLTX-CAR T细胞在种植GBM成瘤动物模型内的抗肿瘤活性:研究者采用PBT-TS颅内种植成瘤的动物模型,评估CLTX-CAR T细胞在体内的杀瘤效应。结果发现,CLTX-CAR T细胞可控制肿瘤生长,延长载瘤动物生存期。然而,对不同PBT-TS颅内种植成瘤的动物模型,CLTX-CAR T细胞的抗肿瘤效应也有所差异。研究发现CLTX-CAR T细胞治疗后复发的肿瘤结合CLTX的能力与未处理的肿瘤相似,说明抗原逃逸不是肿瘤复发的原因。此外,在抗肿瘤期间,表达颗粒酶B的CAR T细胞在输注后14天仍可检测到。相比之下,在复发肿瘤中持续存在的CLTX-CAR T细胞低表达颗粒酶B。同时,与未处理肿瘤相比,复发肿瘤中程序性细胞死亡配体1(PD-L1)表达明显增加。PD-L1表达可被IFNγ信号所诱导,导致肿瘤免疫治疗耐药。CAR干预后,在PBT-TS中PD-L1的诱导与IFNγ受体A表达增加相关。此外,采用CLTX-CAR T细胞与肿瘤细胞共培养的条件培养基处理PBT-TS时,可诱导PD-L1表达显著增加。


4.CLTX-CAR T细胞的脱靶效应低:该研究未检测出CLTX与非肿瘤细胞结合。通过细胞脱颗粒和毒性实验,未发现CLTX-CAR T细胞靶向杀伤非肿瘤细胞。在种植成瘤的GBM动物模型中,观察到CLTX与GBM细胞特异性结合,不与非肿瘤细胞结合。CLTX-CAR T细胞免疫疗法在动物体内实验中未出现不良反应,包括神经系统症状或体重减轻等。上述结果说明CLTX-CAR T细胞特异性靶向杀伤GBM细胞,未见明显的毒副作用。


5.基质金属蛋白酶2参与CLTX-CAR T细胞的靶向治疗:研究发现CLTX-CAR T细胞对不同GBM细胞的效应并不相同。CLTX-CAR T细胞脱颗粒与GBM细胞表达基质金属蛋白酶2(MMP2)关系密切。并且CLTX结合GBM细胞与其表达MMP2相关;结果说明MMP2是CLTX结合GBM细胞的主要介质,并介导CLTX-CAR T细胞活化。


通过下调GBM细胞内的MMP2表达可显著抑制CLTX-CAR T细胞激活及其细胞毒性。干扰体内移植的GBM瘤的MMP2表达也显著抑制CLTX-CAR T细胞的抗肿瘤活性;结果说明MMP2是CLTX-CAR T细胞识别、活化和发挥抗肿瘤作用所必需的重要介质。


此外,添加可溶性MMP2,未激活CLTX-CAR T细胞,也未降低CLTX-CAR T细胞对GBM细胞的毒性。进一步研究发现MMP2参与CLTX-CAR T细胞与GBM细胞形成免疫突触结构是需要与肿瘤细胞中的CLCN3共定位;结果说明细胞膜表面MMP2是CLTX-CAR T细胞激活所必需,而分泌型MMP2既不能激活,也不影响CLTX-CAR的功能。


结论



综上所述,研究发现CLTX-CAR T细胞的安全性高,输注到动物体内未见明显毒副反应;CLTX-CAR T细胞与GBM结合性强,具有强大而特异的靶向杀伤GBM活性,而且无抗原逃逸现象。研究者认为,CLTX-CAR T细胞有别于传统的CAR设计,有望应用于GBM的治疗。


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